深海水域的微生物氧呼吸具有重要的生態(tài)學(xué)意義，但人們對其研究甚少，主要是方法上的困難較多。尤其是微生物的呼吸測量是具有挑戰(zhàn)性的，因為需要高分辨率的氧氣濃度測量設(shè)備。最近關(guān)于氧傳感技術(shù)（丹麥unisense研發(fā)的微電極技術(shù)）的改進克服當(dāng)下研究這些問題的局限性具有很大的潛力。本論文的研究人員主要比較了三種不同的方法來測量低氧濃度下的耗氧量，利用克拉克型氧傳感器(STOX)，光學(xué)氧傳感器(optodes)，質(zhì)譜結(jié)合18-18O2標(biāo)記法。研究人員通過在不同的方法中，以及同樣的實驗設(shè)置中，對比研究三種方法的氧濃度和耗氧量一致性評價，并采用高耗氧量法測定了30-400 nmol L-1h-1的耗氧量精度及相對標(biāo)準(zhǔn)誤差。


Unisense微電極測量系統(tǒng)的的應(yīng)用


unisense公司的氧氣微電極(STOX)應(yīng)用于水生生物的氧的消耗及消耗速率的測試。STOX氧氣微電極采用傳統(tǒng)的兩點法進行矯正，研究過程中將STOX型微電極插入到特制的玻璃瓶中，測試玻璃品的水生生物的耗氧速率，并同步采用光學(xué)氧傳感法及質(zhì)譜法測試含有水生生物的玻璃瓶中的氧的消耗速率。


實驗結(jié)果


研究發(fā)現(xiàn)所有方法均適用于O2消耗量的檢測，反應(yīng)速率在幾個nmol L-1h-1和低濃度O2的范圍內(nèi)，研究結(jié)果測試出了海洋環(huán)境下的海洋生物預(yù)期的氧的消耗速率。其中氧的消耗速率的具體限制需要控制如微電極傳感器的漂移(STOX)和氧的污染(Exetainer)的最小化以達到低檢測限，并充分利用傳感器帶來的特定精度和測量頻率。潛在檢測限為24小時潛伏期為幾個nmol L-1h-1或更少，但各有差異的方法。對于連續(xù)測量和極低的氧消耗速率，推薦使用STOX傳感器（unisense微電極）和光電法。研究發(fā)現(xiàn)在低氧濃度下培養(yǎng)是一個特殊的挑戰(zhàn)，比如聚集體的存在是否可以限制擴散速率預(yù)期濃度低于20umol L-1，并要考慮有限的氧氣消耗的本身擴散，樣品需要更加精細化的處理，以便更好地在原位條件下繁殖并考慮到其聚合體的大小和分布。

圖1、實驗培養(yǎng)裝置圖。孵育瓶置于恒溫水浴中。兩個光學(xué)氧傳感器被放置在瓶的上半部分相對的兩側(cè)。該STOX傳感器是通過一個玻璃管插入瓶的中心。校正的過程是通過壓力補償口加入已知的空氣飽和量的水。容器下方通過磁力攪拌器旋轉(zhuǎn)。

圖2、水培養(yǎng)瓶用18O2標(biāo)記。標(biāo)記的水以0.73 mL min-1的流量泵出瓶子的薄膜入口穿過質(zhì)譜儀。水是通過一個氣密袋中脫去無標(biāo)記氧的水后定位在上邊緣的壓力進入取而代之。氦氣作為載體氣體，具有質(zhì)量穩(wěn)定、速度快的特點。

圖3、實驗1:光學(xué)氧傳感器和全量程光學(xué)氧傳感器(全范圍)和STOX傳感器測試體系中的氧濃度的示意圖。脫氣水依次富集，通過加入已知體積的飽和空氣水(箭頭)來補充氧氣。消耗率計算后，增加的O2隨時間減少。30小時后加入ZnCl2停止生物活性。插圖表示的是在最初幾個小時內(nèi)的光電子初始適應(yīng)情況。

圖4、對比幾種測試方法氧氣隨時間的變化情況。實驗結(jié)束后用光電子和STOX傳感器測量氧氣消耗速率，調(diào)節(jié)O2濃度為1.2 umol L-1(A)、5.5 umol L-1(B)、umol L-1(C)，加入20ml ZnCl2后圖(D)，線性擬合用直線表示。其中時間和濃度軸的縱橫比(umol L-1 h-1)對于所有允許的圖形都是相同的坡度上進行比較的。

圖5、比較膜入口質(zhì)譜法（MIMS）和安培電流法（STOX）傳感器（unisense氧微電極）。O2的濃度和消耗率測量后，添加1.2 umol 18-18O2 L-1(圖A箭頭所示.單個MIMS法的測量值(灰色點)取平均值(黑點)，并用相應(yīng)的點表示標(biāo)準(zhǔn)差。整個實驗運行3小時同時測量。(B)用于氧的消耗速率計算。

表1、三種不同方式測量的氧的耗速率、方法設(shè)置和統(tǒng)計。表1中總結(jié)了不同O2濃度(O2)、不同傳感器和采樣頻率下測量的O2消耗耗率。由式(1)和式(2)計算各速率測量值、標(biāo)準(zhǔn)差(SE)和殘差均方根(RMSRES)及潛在的檢出率極限，假設(shè)培養(yǎng)24小時由公式3計算。請注意較低的RMSRES表示較高的精度和潛在的速率檢測限制只基于精度和測量頻率，而不考慮傳感器漂移或O2污染帶來的可能限制。

圖6、耗氧速率與O2濃度的關(guān)系。實驗1、實驗2、實驗3的耗氧量被總結(jié)并繪制在各自孵育的初始O2濃度上。實驗3中的虛線表示由公式4估算出的擴散極限速率，假設(shè)總直徑(r0)為0.14 mm。其中實驗1的獲得的氧消耗速率也隨著培養(yǎng)時間的增加而增加，同時也能反映細菌隨時間的增長。

表2、不同測試方法在精度、檢出限和適用性方面進行比較圖。表中的評級方案采用符號表示:正常(+)、強(++)和非常強(+++)。同時比較了傳感器的易損性、現(xiàn)場操作性和易損件的價格對比情況。


總結(jié)


由于深海屬于的微生物的氧呼吸具有重要的生態(tài)學(xué)意義，因此研究人員需要找到一種測試方法能夠準(zhǔn)確的測試出深海水域的微生物的呼吸速率，由于微生物的氧呼吸的濃度特別低，因此需要具有高分辨率的氧濃度測試設(shè)備，并且其檢測限能夠達到nmol/L，這對于設(shè)備的要求非常高，而丹麥unisense公司開發(fā)的氧微電極能夠很好的完成這些測試，研究人員為了能夠獲得海水中微生物的氧的消耗速率的準(zhǔn)確性，同步使用了光學(xué)氧傳感器以及質(zhì)譜法來同步驗證，對于連續(xù)測量和極低的氧消耗速率，推薦使用STOX傳感器（unisense微電極）和光學(xué)氧傳感器，而相比于光學(xué)氧傳感器，STOX傳感器的使用成本較低，非常適合研究人員應(yīng)用與微生物的氧消耗測試，并且相比于其他方法，也具有較高的精度，尤其是在低氧濃度下培養(yǎng)的微生物的呼吸速率的測試，因為這些微生物的聚集體的存在是存在一定的擴散速率，需要考慮的擴散限制氧氣消耗情況，而unisense微電極具有測試速度響應(yīng)快、受氧氣擴散消耗的影響小等優(yōu)點，可以在原位條件實現(xiàn)對微生物的氧呼吸速率的測試，這也說明unisense微電極在低氧濃度的海洋環(huán)境中的水生生物的呼吸速率的測試具有非常好的應(yīng)用前景。