氫氣(H2)無色無味，是自然界最小的分子，同時也是宇宙中含量最多的元素。過去H2被認為是生物惰性氣體。近年來，隨著對其生物學功能的深入研究，研究人員認為H2可能是繼一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)和硫化氫(H2S)之后又一個重要的氣體信號分子。2007年Ohsawa等發(fā)現(xiàn)氫氣可顯著改善腦缺血再灌注損傷，由此引起了對于氫氣的研究熱潮。研究表明，H2對多種人類疾病和病理狀態(tài)都具有明顯的緩解和治療效果，如氫分子在抗氧化、抗炎癥等方面都發(fā)揮著重要作用。此外，H2在植物學上也具有重要的生理作用，其不僅可提高植物對生物/非生物脅迫的抗性，還參與調(diào)控植物的生長發(fā)育。

目前飲用富氫水(hydrogen-rich water，HRW)是常用的攝取氫的方式，水相中氫氣濃度的準確測定是各項研究以及后續(xù)生產(chǎn)應用的前提和基礎。

目前，測定溶液中氫氣濃度的方法主要有電極法、氣相色譜法和氧化還原滴定法。電極法是通過測定溶液中氧化還原電位的變化而確定溶液中氫氣的濃度；氣相色譜法主要依據(jù)樣品成分與色譜柱沸點、極性或吸附性的不同，氣體通過色譜柱時被分離，各種物質(zhì)到達檢測器時間有所不同，從而可以對待測組分進行定性和定量測定；氧化還原滴定法是利用亞甲基藍在膠體鉑催化下與氫氣發(fā)生氧化還原反應使亞甲基藍褪色，通過亞甲基藍的用量計算出溶液中氫氣的含量，但此方法誤差較大，且準確度不高。

基于此，本研究利用氫氣微電極和檢測小體系溶液中氫氣濃度的可行性，以期建立一種可廣泛用于氫氣生物學研究和相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)的氫氣濃度檢測方法。

實驗材料與儀器設備

標準氮氣、氧氣購自北京誠為信氣體有限公司。Milli-Q Advantage A10純水設備購自美國Millipore公司；ZK-300純水氫氣發(fā)生器購自北京中科匯恒技術(shù)開發(fā)有限公司；氫氣微電極購自丹麥Unisense公司，SH-RtTM-Msieve 5A色譜柱；氣相色譜瓶購自美國安捷倫科技有限公司。

飽和HRW的制備

將純水氫氣發(fā)生器制得的氫氣(99.999%)通入100 mL超純水(ddH2O)中以制備HRW，每隔10 min使用氫氣微電極測定一次，直至飽和，氫氣在20℃下溶解度為1.62 mg·L-1[20]。制得飽和HRW后，立即使用ddH2O稀釋，配制成不同濃度的HRW(表1)以用于測定標準曲線，溶液總體系為500.0μL。

表1高濃度和低濃度HRW配制

電極法測定HRW中氫氣濃度

電極極化

將氫氣微電極浸泡于ddH2O中，電極極化電壓設置為1 000 mV，隨后逐漸下降，并最終穩(wěn)定在某一數(shù)值，待此數(shù)值穩(wěn)定10 min以上后，電極極化結(jié)束，可以開始樣品檢測。電極極化時間一般需要1～2 h。

樣品檢測

將500μL不同濃度的HRW置于1.5 mL離心管中，將電極插入液面以下，待信號值穩(wěn)定后，記錄數(shù)據(jù)。

結(jié)果

電極法測定水相中氫氣濃度

標準曲線

利用氫氣微電極分別測定高濃度HRW(0、0.324 0、0.648 0、0.972 0、1.296 0、1.620 0 mg·L-1)及低濃度HRW(0、0.040 5、0.081 0、0.121 5、0.162 0、0.202 5 mg·L-1)中氫氣的濃度。以水相中氫氣濃度為縱坐標，以氫電極的信號值為橫坐標，繪制標準曲線。如圖1A所示，高濃度HRW標準曲線方程為y=0.001 402x-0.028 35，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999 8；如圖1B所示，低濃度HRW標準曲線方程為y=0.001 580x-0.030 28，R2=0.999 7。因此，低濃度、高濃度HRW中，水相中氫氣濃度與氫氣微電極信號值之間均具有良好的線性關(guān)系。

圖1氫電極法檢測水相中氫氣濃度標準曲線

精確度分析及檢出限分析

利用氫氣微電極對某一高濃度(0.72 mg·L-1)、低濃度(0.012 mg·L-1)樣品進行9次平行測定，對該測定方法進行精確度分析，由表2可知在0～1.620 0 mg·L-1范圍內(nèi)，該方法的標準偏差為0.012 9 mg·L-1，變異系數(shù)為1.775 3%。結(jié)果表明該方法精確度較高，滿足水相中高濃度氫氣的測定要求。

表2電極法檢測高濃度和低濃度HRW的精確度分析

由表2可知,在0～0.202 5 mg·L-1范圍內(nèi)，用電極法測定低濃度HRW的樣品的標準偏差為0.001 3 mg·L-1，變異系數(shù)為11.734 0%。根據(jù)1.5中的公式，t(8,1-a=0.99)=3.355 0，MDL=S×t(8,1-a=0.99)=0.004 4 mg·L-1。表明該方法精確度較高，滿足水相中低濃度氫氣的測定要求。

綜上所述，對于需要實時監(jiān)測的樣品，使用氫微電極法較為合適。從檢測方式來看，電極法可以直接實時監(jiān)測水相中氫氣的濃度；但從測定原理來看，電極法根據(jù)溶液中氧化還原電位的變化而測定溶液中氫氣的含量，由于生物樣本成分較為復雜，電極法的測定結(jié)果容易受到多種因素的干擾。