三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate，ATP)是生物體的高能磷酸化合物，還可以作為一種重要的信息遞質(zhì)被釋放到細胞外，在神經(jīng)信息調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答、全身炎癥、組織損傷與死亡、機體正常發(fā)育與體內(nèi)平衡調(diào)控、細胞凋亡與腫瘤細胞清除等生理過程上有重要作用。然而細胞ATP釋放機制及調(diào)控機理尚不明確，揭示這一機制對于理解發(fā)病機制和開發(fā)靶向藥物治療至關(guān)重要，這也是揭開細胞信號轉(zhuǎn)導之謎的關(guān)鍵，因此實現(xiàn)原位監(jiān)測細胞ATP釋放具有十分重要的意義?；谄咸烟茄趸?己糖激酶的電化學ATP生物傳感器，因其獨有的高靈敏度、快速響應(yīng)、連續(xù)監(jiān)測、高時間和空間分辨率等特性，已用于離體或在體ATP釋放檢測。細胞ATP釋放濃度低、釋放速度快，因此具備高靈敏度、低檢測限、快速響應(yīng)、高選擇性、長期穩(wěn)定性好的高性能電化學ATP生物傳感器以及高分辨、快速、動態(tài)原位分析系統(tǒng)極其重要。然而現(xiàn)有研究中存在著微電極制備工藝復(fù)雜、電極有效面積太小、酶活性不高、長期穩(wěn)定性差等問題。

針對這些問題，本論文重點從電極結(jié)構(gòu)和性能設(shè)計兩個方面入手，主要開展了絲網(wǎng)印刷平面電極H2O2傳感器研究、絲網(wǎng)印刷平面電極ATP傳感器性能優(yōu)化、鉑納米棒修飾平面微電極陣列ATP傳感器研究、3D金-鉑納米花修飾針型微電極ATP傳感器研究、細胞ATP受激釋放原位監(jiān)測分析系統(tǒng)及其應(yīng)用研究，并成功用于高鉀溶液誘導PC12細胞ATP釋放的原位監(jiān)測。本論文的主要工作內(nèi)容和創(chuàng)新如下:

(1)提出一步電化學沉積法固定本征石墨烯納米片，構(gòu)建疊層狀本征石墨烯-殼聚糖復(fù)合膜修飾的絲網(wǎng)印刷平面電極H2O2傳感器，檢測靈敏度顯著增強，線性范圍寬，檢測限低。采用掃描電子顯微鏡、傅里葉紅外光譜、拉曼光譜、X射線光電子能譜和電化學循環(huán)伏安掃描等分析技術(shù)對復(fù)合膜進行表征和研究，并優(yōu)化復(fù)合膜制備條件。H2O2傳感器是葡萄糖氧化酶/己糖激酶電化學ATP生物傳感器的基礎(chǔ)，深入探討H2O2傳感器機理，為后續(xù)ATP傳感器研究奠定基礎(chǔ)，且該方法可以推廣到其他納米材料和生物分子的固定化。

(2)實現(xiàn)絲網(wǎng)印刷平面電極ATP傳感器，從催化層修飾和酶固定化等方面出發(fā)，分別探究了鍍鉑電壓和鍍鉑時間、戊二醛用量和交聯(lián)時間、酶層結(jié)構(gòu)和測試環(huán)境中Mg2+濃度等因素對傳感器靈敏度的影響并做了優(yōu)化，優(yōu)化后ATP檢測靈敏度可達20.1μA mM-1 cm-2。探索了ATP傳感器制備過程中的關(guān)鍵步驟參數(shù)，為后續(xù)微電極電化學ATP傳感器制備提供參考。

(3)設(shè)計并加工平面微電極陣列，實現(xiàn)鉑納米棒修飾平面微電極陣列ATP傳感器研究，為后續(xù)細胞ATP釋放監(jiān)測研究中傳感器修飾提供參考。優(yōu)化金-鉑復(fù)合結(jié)構(gòu)制備條件并實現(xiàn)可打磨單一超微平面電極ATP傳感器。采用光學表征驗證不同尺寸微圓盤電極的成功制備。進一步增加電極表面積和提高傳感器靈敏度，在微電極上修飾鉑納米棒。鉑納米棒的修飾使傳感器靈敏度提高27倍，檢測限低至20μM。

(4)提出一種簡易微電極封裝方法和無模板電沉積層層自組裝3D雙金屬金-鉑納米花結(jié)構(gòu)，構(gòu)建針型微電極高性能電化學ATP傳感器，有望用于后續(xù)細胞ATP釋放監(jiān)測研究。采用掃描電子顯微鏡、能量散射光譜和電化學阻抗分析等對納米花進行表征，并探究氯金酸濃度和鍍金時間對傳感器靈敏度的影響。優(yōu)化后ATP靈敏度為2.28±0.19 nAμM-1 mm-2，線性動態(tài)范圍為2.5μM～447μM，檢測下限為2.5μM(S/N=3)。在4℃的PBS溶液中存儲兩周后，ATP傳感器的葡萄糖靈敏度仍有初始的95.44±6.97%，ATP靈敏度仍有初始的79.39±9.15%。該傳感器檢測限低、長期穩(wěn)定性優(yōu)異和選擇性高，源于3D雙金屬金-鉑納米花出色催化活性和較大電活性表面積有助于保持酶活性和長期穩(wěn)定性。

(5)設(shè)計并實現(xiàn)了細胞ATP受激釋放原位監(jiān)測分析系統(tǒng)，并成功應(yīng)用于高鉀溶液誘導PC12細胞ATP釋放的原位監(jiān)測研究。設(shè)計并完成三電極系統(tǒng)、微操縱臺及控制器、CCD成像系統(tǒng)和電化學分析儀器的系統(tǒng)集成。從待測細胞選擇、刺激源選擇、細胞實驗細節(jié)討論、細胞實驗結(jié)果有效性論證及對比實驗角度，進一步完善細胞實驗。檢測到的電流下降幅度約為21.6±3.4 nA(N=6)，對應(yīng)于ATP濃度為12.2±2.8μM，這一濃度與文獻水平一致，均在微摩爾級別。該原位分析系統(tǒng)可用于進一步探究糖酵解和細胞凋亡過程中ATP濃度變化，還可為其他神經(jīng)遞質(zhì)和細胞分泌物的原位監(jiān)測研究提供參考。