細胞電融合技術(shù)自發(fā)明以來，由于其可控性強、操作簡便、對細胞無毒害等優(yōu)點而得到廣泛應(yīng)用，逐漸成為現(xiàn)代生物工程技術(shù)中的一個重要工具，被廣泛應(yīng)用于雜交育種、單克隆抗體制備、藥物篩選等領(lǐng)域。隨著微流控技術(shù)和微加工技術(shù)的發(fā)展，細胞電融合芯片技術(shù)在最近十幾年發(fā)展尤為迅速。細胞電融合芯片技術(shù)除了具有傳統(tǒng)細胞電融合技術(shù)的優(yōu)點，還更精確高效、集成度高、便于實驗觀察、樣本消耗少，因此在國內(nèi)外廣受關(guān)注。

本論文運用現(xiàn)代微加工技術(shù)制作了基于微電極陣列的細胞電融合芯片，利用介電電泳效應(yīng)和細胞電穿孔原理實現(xiàn)細胞排隊和電融合。細胞排隊和電穿孔是電融合中兩個最重要的過程，本論文首先對它們的機制和模型進行了深入探討。在此基礎(chǔ)上，運用有限元方法分析了介電電泳效應(yīng)下細胞的運動狀態(tài)以及電極結(jié)構(gòu)對細胞跨膜電位分布的影響，并根據(jù)仿真結(jié)果來優(yōu)化微電極陣列芯片結(jié)構(gòu)，使電融合過程控制得到優(yōu)化?；诜抡娣治鲈O(shè)計了離散式電極和離散式凹槽電極結(jié)構(gòu)模型，并且對芯片加工工藝、材料、封裝技術(shù)等進行了研究，成功研制了基于薄膜電極、離散式共面電極、離散式凹槽電極結(jié)構(gòu)的細胞電融合芯片。最后，在芯片和融合儀組成的細胞電融合平臺上進行了多種細胞的電融合實驗，驗證了新方法的有效性。

具體的說，論文研究的主要工作包括以下幾點:

①細胞電融合理論分析及仿真研究在細胞介電電泳、細胞電穿孔等相關(guān)理論研究基礎(chǔ)上，利用有限元分析軟件COMSOL Multiphysics#174；對芯片內(nèi)介電電泳效應(yīng)下的細胞運動狀態(tài)進行了分析，為相應(yīng)的細胞排隊控制方法的建立與優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。同時，建立了基于跨膜電位的單細胞穿孔模型，分析了電場分布態(tài)勢誘導(dǎo)的細胞跨膜電位分布情況，以及該效應(yīng)下電穿孔區(qū)域分布及電穿孔密度分析等；在此基礎(chǔ)上，基于電場聚焦效應(yīng)，分析了離散式共面電極、弧性凹槽電極、矩形凹槽電極結(jié)構(gòu)參數(shù)對電場分布態(tài)勢的影響，探討了各電極結(jié)構(gòu)下細胞跨膜電位分布情況，并從中選取定型了較優(yōu)的凹槽微電極陣列，研制了對應(yīng)的微流控芯片，從而優(yōu)化了電穿孔/電融合過程控制，可以有效避免多細胞融合以及改善融合率等。

②細胞電融合微流控芯片的優(yōu)化在理論分析和仿真計算基礎(chǔ)上，從芯片結(jié)構(gòu)、材料、加工工藝、封裝等方面對細胞電融合芯片進行優(yōu)化設(shè)計，研制了三種芯片:基于薄膜電極、基于離散式共面電極、基于離散式凹槽電極的細胞電融合芯片。在材料選擇上主要采用低阻硅、金、鋁作為電極材料，采用聚酰亞胺多聚物、“Si O2-多晶硅-Si O2絕緣槽”+“浮地硅”結(jié)構(gòu)填充兩相鄰?fù)过X狀微電極之間的凹陷區(qū)；選擇了石英玻璃、SOI等材料作為芯片基底；同時選擇了軟光刻、IC工藝等制造工藝。這一系列芯片在實驗中表現(xiàn)出良好的生物相容性、抗化學(xué)腐蝕性及電氣性能等。

③基于微流控芯片的細胞電融合系統(tǒng)平臺的建立根據(jù)實驗要求，利用細胞電融合芯片和細胞電融合儀，搭建了基于微陣列電極芯片的細胞電融合系統(tǒng)平臺。該實驗平臺具有操作簡便、可控性好、實驗效果好等特點。通過顯微鏡和CCD構(gòu)成的圖像觀察和采集系統(tǒng)，可以清晰觀察并記錄細胞電融合的全過程，并且實驗中可根據(jù)融合情況隨時調(diào)整融合參數(shù)，獲得理想的排隊效率及融合效率。

④微流控芯片上細胞電融合驗證實驗研究及分析利用基于微流控芯片的細胞電融合系統(tǒng)平臺研究了多種細胞的排隊、融合實驗條件和參數(shù)，包括K562細胞、NIH3T3細胞、成肌細胞等。新研制的芯片解決了細胞吸附在凹陷區(qū)無法融合這一問題。此外，這些新設(shè)計的微電極也使電場更加集中，降低了排隊電壓和融合電壓。通過反復(fù)實驗探索獲得了細胞排隊及融合所需的電參數(shù)，并且得到了較高的細胞排隊率與細胞融合率。相對于PEG方法和傳統(tǒng)電融合法，新設(shè)計的微電極芯片的排隊及融合效率有了顯著提高，其中在薄膜電極芯片上K562細胞兩兩排隊效率為70.7%，融合率達到大約43.1%的水平；在離散式共面電極芯片上，幾乎100%的NIH3T3細胞排列在電極上，兩兩排隊效率達到69.8%，融合效率達到40%；在離散式凹槽電極芯片上，98%的NIH3T3細胞進入凹槽，大約67.9%凹槽內(nèi)的細胞兩兩排隊，融合效率達到了50.3%。

總之，通過對細胞電融合芯片的優(yōu)化設(shè)計，本論文研制出高排隊效率、高融合率的細胞電融合芯片，建立了集成融合芯片及電融合儀的細胞電融合微系統(tǒng)實驗平臺。在對多種細胞的電融合實驗中，取得了較好的實驗效果。該研究為建立高效、自動的細胞融合芯片系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)，有望進一步應(yīng)用于實際研究，如雜交育種、體細胞再程序化等。