熱線：021-56056830,66110819
手機(jī)：13564362870
研究簡(jiǎn)介:報(bào)道了一種新的甲烷氧化菌——Methylomonas denitrificans FJG1菌株，它能夠在低氧條件下將甲烷氧化與硝酸鹽還原耦合，并以一氧化二氮（N2O）作為最終產(chǎn)物釋放。這項(xiàng)研究擴(kuò)展了我們對(duì)好氧甲烷氧化菌在碳和氮循環(huán)中作用的理解，并為這些細(xì)菌在厭氧生態(tài)系統(tǒng)中的豐度和活性提供了新的解釋。研究者使用微傳感器測(cè)量和Illumina RNA-Seq技術(shù)，發(fā)現(xiàn)FJG1菌株在氧限制條件下能夠激活之前未知的反硝化途徑，并且這種途徑的基因表達(dá)與硝酸鹽的可用性有關(guān)。特別地，研究揭示了在低氧條件下，F(xiàn)JG1菌株能夠利用甲烷作為電子供體，通過(guò)反硝化途徑將硝酸鹽還原為N2O，同時(shí)通過(guò)這一過(guò)程保存能量。本文章強(qiáng)調(diào)了這種代謝靈活性對(duì)好氧甲烷氧化菌在自然環(huán)境中生存和功能的重要性。
在氧限制的環(huán)境中，如油砂尾礦池、凍土土壤和高緯度泥炭土壤等，這些細(xì)菌可能通過(guò)耦合甲烷氧化和硝酸鹽還原來(lái)維持其代謝活動(dòng)，這不僅有助于減少溫室氣體甲烷的排放，也可能影響氮循環(huán)和N2O的產(chǎn)生。此外研究還發(fā)現(xiàn)了與甲烷氧化有關(guān)的pxmABC操縱子在低氧和硝酸鹽存在的條件下表達(dá)上調(diào)，暗示了可能存在一種新型的甲烷單加氧酶，這可能在低氧條件下的甲烷代謝中發(fā)揮作用。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)在低氧條件下，與氧結(jié)合的球蛋白表達(dá)水平上升，這可能是一種將稀缺氧氣輸送至甲烷單加氧酶的機(jī)制。這項(xiàng)研究不僅發(fā)現(xiàn)了一種新的甲烷氧化菌，還揭示了其在低氧條件下獨(dú)特的代謝途徑，這對(duì)理解微生物在全球元素循環(huán)中的作用具有重要意義。
Unisense微呼吸系統(tǒng)的應(yīng)用
Unisense微呼吸系統(tǒng)（MicroRespiration,MR chamber）被用來(lái)測(cè)量和分析Methylomonas denitrificans sp.nov.strain FJG1在不同條件下的代謝活動(dòng)，特別是氧氣（O2）、甲烷（CH4）、一氧化二氮（N2O）的消耗和產(chǎn)生情況。首先從在NMS（硝酸鹽礦物鹽培養(yǎng)基）或AMS（銨礦物鹽培養(yǎng)基）中培養(yǎng)了120小時(shí)的細(xì)菌培養(yǎng)物中收集大約1×1011個(gè)細(xì)胞。使用過(guò)濾裝置和0.2μm的濾膜收集細(xì)胞，然后用新鮮的礦物鹽培養(yǎng)基洗滌三次，并重新懸浮在10 ml的培養(yǎng)基中。將洗滌后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到10 ml的unisense的MicroRespiration（MR）微呼吸瓶中，不留任何空隙。MR室配備了OX-MR O2傳感器和N2O-500 N2O傳感器。通過(guò)直接注射的方式向MR室內(nèi)添加硝酸鹽（NO3?，最終濃度1 mM）、亞硝酸鹽（NO2?，最終濃度1mM）和一氧化氮供體（ProliNONOate，每2.5分鐘6 nmol）。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，監(jiān)測(cè)O2和N2O濃度變化，以評(píng)估細(xì)胞在不同條件下的代謝活動(dòng)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
揭示了一種新型的好氧甲烷氧化菌——Methylomonas denitrificans FJG1菌株，它在低氧條件下展現(xiàn)出了將甲烷氧化與硝酸鹽還原耦合的能力，最終產(chǎn)生一氧化二氮（N2O）。FJG1菌株能夠利用甲烷作為電子供體，在缺氧條件下將硝酸鹽還原為N2O，這一過(guò)程表明了甲烷氧化菌在氮循環(huán)中的潛在作用。N2O的形成依賴于硝酸鹽的可用性和低氧條件，這表明了環(huán)境因素對(duì)甲烷氧化菌代謝途徑的重要影響。在氧限制條件下，F(xiàn)JG1菌株通過(guò)反硝化途徑進(jìn)行能量保存，這為理解這類細(xì)菌在低氧環(huán)境中的生存策略提供了新的視角。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，與反硝化途徑相關(guān)的基因在缺氧和硝酸鹽存在的條件下表達(dá)上調(diào)，這證實(shí)了生理和分子層面上對(duì)代謝途徑的調(diào)控。
圖1、Methylomonas denitrificans sp.nov.株FJG1T在AMS和NMS培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)、甲烷和氧氣消耗以及一氧化二氮產(chǎn)生。M.denitrificans sp.nov.株FJG1T在封閉的玻璃瓶中以100 ml的AMS或NMS培養(yǎng)基培養(yǎng)120小時(shí)，瓶蓋為丁基橡膠隔膜帽，氣體頭空間的混合比例為3:7，甲烷對(duì)氧氣。使用平板閱讀器在600 nm處測(cè)量光密度（A），并使用氣相色譜-熱導(dǎo)檢測(cè)器（GC-TCD）測(cè)量氣體頭空間中的甲烷（B）、氧氣（C）和一氧化二氮（D）濃度。所有數(shù)據(jù)點(diǎn)表示n=6的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
圖2.Methylomonas denitrificans sp.nov.株FJG1T在氧氣限制條件下將甲烷氧化與硝酸鹽、亞硝酸鹽和一氧化氮還原耦合。實(shí)驗(yàn)在封閉的10 ml微呼吸室中進(jìn)行，該室配備了氧氣和一氧化氮或一氧化二氮微傳感器，并使用SensorTrace Basic軟件記錄數(shù)據(jù)。氧氣（黑色三角形）和一氧化二氮/一氧化氮（灰色菱形）。箭頭標(biāo)記了甲烷、硝酸鉀（1 mM）、CCCP（200μM）、亞硝酸鈉（1 mM）或Proli NONOate（每2.5分鐘6 nmol/注射）的添加時(shí)間。
圖3、在<50 nM氧氣條件下，硝酸鹽還原為一氧化二氮依賴于甲烷。實(shí)驗(yàn)在封閉的10 ml微呼吸瓶中進(jìn)行，該室配備了氧氣和一氧化二氮微傳感器，并使用SensorTrace Basic軟件記錄數(shù)據(jù)。氧氣（黑色鉆石）和一氧化二氮（灰色正方形）。箭頭標(biāo)記了甲烷的添加時(shí)間。
圖4.在氧氣限制條件下，Methylomonas denitrificans sp.nov.株FJG1T的ATP產(chǎn)生和氧氣消耗。Methylomonas denitrificans sp.nov.株FJG1T在100 ml的NMS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在封閉的250 ml玻璃瓶中進(jìn)行120小時(shí)，氣體頭空間混合比例為3:7，甲烷對(duì)氧氣。柱狀圖表示ATP含量（黑色-AMS，灰色-NMS），線條表示氣體頭空間中的氧氣濃度（AMS-黑色正方形，NMS-灰色三角形）。使用BacTiter-Glo Microbial Cell Viability Assay(Promega)在發(fā)光度計(jì)上測(cè)量ATP，并使用GC-TCD測(cè)量氣體頭空間中的氧氣濃度。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表n=6的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
結(jié)論與展望
屬于Gammaproteobacteria門的專性甲烷氧化菌Methylomonas denitrificans新種FJG1菌株能夠在氧氣限制條件下將甲烷氧化與硝酸鹽還原耦合，并以一氧化二氮（N2O）作為最終產(chǎn)物釋放。雖然一些好氧甲烷氧化菌的基因組編碼了假定的氮氧化物還原酶，但這些代謝模塊是否用于NOx解毒、反硝化或其他目的尚不清楚。本研究通過(guò)unisense微呼吸傳感器測(cè)量證明FJG1菌株在低氧條件下能夠進(jìn)行上述耦合反應(yīng)。Illumina RNA-Seq數(shù)據(jù)分析揭示了FJG1菌株響應(yīng)低氧條件的基因表達(dá)差異，包括之前未知的反硝化途徑的基因以及pxmABC操縱子。生理和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明，編碼反硝化途徑的遺傳庫(kù)存僅在氧限制條件下硝酸鹽可用時(shí)才會(huì)上調(diào)。Unisense微呼吸系統(tǒng)為研究Methylomonas denitrificans FJG1菌株在低氧條件下的代謝途徑提供了一個(gè)強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)工具，unisense微呼吸傳感器能夠精確測(cè)量微呼吸瓶?jī)?nèi)的氣體消耗和產(chǎn)生速率，這對(duì)于了解FJG1菌株在特定條件下的代謝活性和效率至關(guān)重要。支持了FJG1菌株在低氧條件下通過(guò)反硝化途徑進(jìn)行能量代謝的假設(shè)，使得研究人員能夠在受控的微環(huán)境中詳細(xì)監(jiān)測(cè)和分析細(xì)菌的代謝活動(dòng)。此外，ATP水平的定量表明，反硝化途徑使用諸如硝酸鹽還原酶NarGH等庫(kù)存，使FJG1菌株能夠在氧限制期間保存能量。本研究揭示了好氧甲烷氧化菌在碳和氮循環(huán)代謝交叉點(diǎn)的意外代謝靈活性。
