齲病是口腔常見(jiàn)的感染性疾病之一。牙菌斑生物膜的形成是齲病形成的首要因素，而變異鏈球菌則是牙菌斑中主要的致齲菌之一。變異鏈球菌等產(chǎn)酸細(xì)菌通過(guò)分解糖類產(chǎn)酸，降低菌斑局部pH使牙面脫礦，最終形成齲損。這些酸性代謝產(chǎn)物是造成牙齒脫礦最直接的原因。目前，檢測(cè)菌斑基質(zhì)中pH值主要采用pH染料、微電極等方法，但這些測(cè)量方法常為非原位測(cè)量的方法，易帶入其他混雜因素。

變異鏈球菌是牙菌斑生物膜中的重要成員，該菌能夠代謝糖類產(chǎn)酸，降低局部pH，抑制其余細(xì)菌（如血鏈球菌）的生長(zhǎng)，在競(jìng)爭(zhēng)中逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌。同時(shí)變異鏈球菌具有耐酸性，可以在低pH的環(huán)境中正常生長(zhǎng)，并且產(chǎn)生更多的酸，使環(huán)境始終處于低pH狀態(tài)。牙菌斑生物膜形成迅速且較難清除，其中的微生物代謝產(chǎn)生的乳酸等酸性物質(zhì)不易流出亦不易被唾液中和，故可造成牙菌斑底部附著牙面的局部長(zhǎng)期低pH環(huán)境。齲病的發(fā)生就始于局部低pH環(huán)境造成的牙體脫礦。由此可見(jiàn)，相對(duì)于細(xì)菌本身而言，其產(chǎn)酸造成的菌斑附著表面的低pH環(huán)境才是齲病發(fā)生的直接因素。如何直觀準(zhǔn)確地反映菌斑pH顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的低pH感應(yīng)系統(tǒng)以致齲微生物——變異鏈球菌作為報(bào)告菌，可用于與齲相關(guān)的微生物及微生態(tài)研究，不帶入其他影響因素，使用范圍廣。

目前，生物膜pH的測(cè)量方法大致有以下幾種。1）接觸式電極測(cè)量法：將微電極插入待測(cè)部位進(jìn)行探測(cè)。2）取樣檢測(cè)法：將待測(cè)部位菌斑收集起來(lái)，再通過(guò)pH計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。這兩種方法簡(jiǎn)單、便宜、靈活，但具有測(cè)量時(shí)會(huì)擾亂待測(cè)部位生物膜，測(cè)試時(shí)間不連續(xù)，唾液緩沖作用影響大，非原位檢測(cè)等缺點(diǎn)。3）內(nèi)在電極測(cè)量法：將微電極事先置于未形成生物膜的物體表面（如義齒基托、培養(yǎng)皿底部等），然后置于患者口內(nèi)或接入細(xì)菌，即可通過(guò)無(wú)線電技術(shù)連續(xù)長(zhǎng)期地檢測(cè)pH。這種方法不擾亂生物膜的形成且為原位檢測(cè)，但其價(jià)格昂貴、操作復(fù)雜。4）pH染料法：使用商品化的pH熒光染料對(duì)生物膜進(jìn)行染色和檢測(cè)。此方法中pH染料染色的操作易受生物膜厚度和表面粗糙程度等因素的影響，造成實(shí)驗(yàn)誤差?？傮w來(lái)說(shuō)，生物膜pH的測(cè)量方法不盡如人意，研究者們渴望尋得一種方便、廉價(jià)、連續(xù)原位測(cè)量且誤差較小的測(cè)量方法。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的變異鏈球菌低pH感應(yīng)系統(tǒng)，于生物膜原位檢測(cè)pH，檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，可最大程度還原生物膜局部的真實(shí)pH高低狀態(tài)，減少人為因素帶入的影響。

不同pH和處理時(shí)間變異鏈球菌低pH感應(yīng)系統(tǒng)單位面積熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)圖

唾液鏈球菌尿素酶編碼基因ureⅠ的啟動(dòng)子pureⅠ酸誘導(dǎo)性強(qiáng)，機(jī)制較清楚。CodY蛋白與RNA聚合酶競(jìng)爭(zhēng)pureⅠ上的結(jié)合位點(diǎn)，而pH的高低則決定CodY蛋白與結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合與解離。本課題組發(fā)現(xiàn)，變異鏈球菌中的CodY蛋白與唾液鏈球菌中的CodY蛋白高度同源，且有研究者將該啟動(dòng)子轉(zhuǎn)入格氏鏈球菌中并驗(yàn)證了該啟動(dòng)子在鏈球菌屬其他菌種中也可以正常發(fā)揮酸誘導(dǎo)特性。研究中展望了使用該啟動(dòng)子連接一段報(bào)告基因以制作生物膜pH探針的應(yīng)用前景。GFP具有熒光穩(wěn)定，非種屬特異，不影響細(xì)胞正常生理功能，可用于活細(xì)胞直接觀測(cè)等特點(diǎn)，其編碼基因常被作為報(bào)告基因用于啟動(dòng)子功能驗(yàn)證，報(bào)告菌株構(gòu)建，蛋白質(zhì)定位以及分泌的檢測(cè)等，也曾被用于變異鏈球菌中研究gtfB基因的表達(dá)調(diào)控。故本實(shí)驗(yàn)將啟動(dòng)子pureⅠ與gfp基因連接轉(zhuǎn)入變異鏈球菌中，從而構(gòu)建受環(huán)境pH調(diào)節(jié)熒光強(qiáng)弱的變異鏈球菌低pH報(bào)告系統(tǒng)。該系統(tǒng)感受環(huán)境pH的受體位于核酸層面，調(diào)控精度高，從而提高了此系統(tǒng)的準(zhǔn)確性。

本研究在變異鏈球菌低pH感應(yīng)系統(tǒng)的驗(yàn)證中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)14 h后的生物膜樣本已檢測(cè)出較弱熒光，但熒光強(qiáng)度明顯低于處理后。筆者認(rèn)為，造成此現(xiàn)象的原因可能是：1）由于變異鏈球菌代謝產(chǎn)酸，雖已使用50%BHI培養(yǎng)基降低營(yíng)養(yǎng)，并于培養(yǎng)基中加入酸堿緩沖劑Pipes，但經(jīng)檢測(cè)培養(yǎng)14 h后培養(yǎng)基仍處于弱酸性；2）質(zhì)粒在變異鏈球菌中為多拷貝狀態(tài)，而變異鏈球菌基因組codY基因?yàn)閱慰截?。變異鏈球菌產(chǎn)生的CodY蛋白不足以在接近中性pH的環(huán)境下將pureⅠ啟動(dòng)子完全阻遏，故仍可有GFP的合成。本課題組后期實(shí)驗(yàn)計(jì)劃將融合片段pureⅠ-gfp整合到變異鏈球菌基因組中，以期具有更精確靈敏的pH感應(yīng)作用。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了變異鏈球菌低pH感應(yīng)系統(tǒng)。該系統(tǒng)可在一定的范圍內(nèi)原位反映生物膜局部pH狀態(tài)，具有一定的應(yīng)用前景。同時(shí)，本研究驗(yàn)證了唾液鏈球菌尿素酶基因的啟動(dòng)子pureⅠ在變異鏈球菌中可以正常發(fā)揮酸誘導(dǎo)功能，為日后進(jìn)一步將該啟動(dòng)子應(yīng)用于變異鏈球菌基因表達(dá)調(diào)控的相關(guān)研究提供了理論基礎(chǔ)。